La sorprendente verdad sobre el papel del estroncio en la regeneración ósea.

Te contamos lo que no sabías sobre la tecnología innovadora del uso de estroncio como andamio

Es posible regenerar hueso en aquellas lesiones óseas que no se pueden curar. ¿Cómo? 

Nos vamos a basar en los resultados y conclusiones del artículo "Strontium ion reinforced bioceramic scaffold for load bearing bone regeneration", cuyo objetivo es determinar el porcentaje de estroncio que promueve el crecimiento de células madre a través de un andamio, llamado SrHAB (strontium substituted hydroxyapatite based bioceramic).

Como seguramente sabes, la principal función de los huesos es dar soporte y protección a los órganos del cuerpo. Cuando estos presentan defectos a causa de traumatismos y/o patologías, las consecuencias pueden ocasionar enfermedades que tienden a empeorar progresivamente, dejando en la mayoría de los casos la pérdida de la función ósea. 

Para la curación de estos tejidos óseos, se utiliza comúnmente los injertos autólogos, lo cuales provenienen de los huesos del propio cuerpo del individuo [1]. Sin embargo, esta técnica presenta algunas limitaciones como la morbilidad del sitio donante y la cantidad que se puede extraer del mismo [2]. 

Partiendo de esta problemática, se han desarrollado alternativas como aloinjertos, xenoinjertos y biomateriales sintéticos. Aún así, hay dos principales desventajas con estos métodos, que se han identificado a lo largo de los años:

1. Los aloinjertos y xenoinjertos tienen limitaciones como la posibilidad de transmisión de enfermedades. 

2. Los biomateriales sintéticos, los biometales y sus aleaciones requieren múltiples cirugías y protección contra tensiones. 

De hecho, las partículas de desgaste residuales, que en su mayoría son tóxicas, se mueven por el organismo y causan otro tipo de problemas en la salud. 

También se han usado diferentes mecanimos como vidrios bioactivos[2]. Sin embargo, el artículo citado nos enseña una alternativa muy innovadora que queremos abordar a continuación: Los andamios. 

 Seguro te preguntarás: ¿Qué es un andamio?

Entrando en materia, un andamio es un material especialmente diseñado para promover el crecimiento celular  y la formación de nuevos tejidos funcionales. El objetivo es cultivar células para que, progresivamente, se formen estructuras capaces de soportar la generación de tejido, es decir que imiten la matriz ósea natural [3].

Los andamios deben tener resistencia mecánica adecuada, y el uso solo de biocerámicas se limita por la fragilidad de las mismas. La posibilidad de reforzar el andamio con otro material brindan un mayor soporte mecánico y facilitan la restauración de los defectos óseos [4].

Precisamente, en la investigación se desea analizar el efecto de la cantidad de estroncio en los andamios biocerámicos a base de hidroxiapatita sustituida con estroncio (SrHAB), en donde se comparan los resultados de la actividad in vitro de la enzima Fosfatasa alcalina empleando porcentajes de dicho metal de 10%, 30% y 50%. 

 ¿Y por qué estroncio?

Curiosamente, el estroncio se utiliza como fármaco para el tratamiento de la pérdida ósea osteoporótica. Cumple dos importantes funciones en la formación del hueso: estimular los osteoblastos e inhibir la actividad de los osteoclastos [2]. 

Figura 1. Estroncio[5]

Estudios también indican que el aumento del porcentaje de estroncio en los vidrios bioactivos basados ​​en sol gel, reduce la formación de la capa de hidroxiapatita carbonatada (HCA), la cual afecta la bioactividad del andamio[8].

 ¿Cómo se fabrica el andamio?

Primera etapa: Fabricación y caracterización

Añadir un metal a la biocerámica. Esto se logra con los siguientes pasos: 

• Disolver ortosilicato de tetraetilo (TEOS) en etanol absoluto. 
• Añadir a la disolución, una mezcla de nitrato de calcio, nitrato de estroncio, fluoruro de calcio y nitrato de magnesio en ácido ortofosfórico. En este punto se obtienen las composiciones de estroncio con las concentraciones especificadas anteriormente (10%, 30% y 50%). 
• Calentar la disolución y dejar que se gelifique durante la noche.  
• El gel formado luego es calcinado en un horno eléctrico a 600°C durante tres horas, obteniendo un polvo.
• Compactar  dicho polvo a 1200°C durante dos horas. 

Con lo anterior, obtenemos 3 tipos de biocerámicas sustituidas según el porcentaje de concentración incorporado, en donde el andamio Sr10HAB contiene 10% de estroncio, el Sr30HAB comprende 30% y el Sr50HAB incluye 50% de dicho metal. 

A los andamios obtenidos se les evaluó las características fisiológicas del material, tales como: porisidad, estructura cristalina, difracción, propiedades mecánicas y liberación cuantitativa de iones. 

Lo anterior, por cuanto es necesario determinar la calidad del material antes de realizar las pruebas de validación, que son las que finalmente nos indicarán cuál es la concentración óptima para emplear en el material de andamio, y así cumpla con los requisitos establecidos. 

Segunda etapa: Cultivo y proliferación celular

Para garantizar que los resultados fueran confiables, la investigación propone emplear un medio de cultivo celular sintético al que llaman "Minimum essential media" (MEM) junto con otros compuestos que aportaran los nutrientes necesarios para promover y controlar el crecimiento celular, tales como suero fetal bovino (FBS), penicilina y estreptomicina. 

Algo muy importante en toda investigación, es tener en cuenta que se debe usar un control como referencia para interpretar los resultados. En este caso, el medio de cultivo de control, además de tener los mismos componentes previamente mencionados, también comprende: Ácido L-ascórbico 2-fosfato, β-glicerol fosfato, 1α, 25-dihidroxivitamina D3 y dexametasona. 

Para cultivar las células, se esterilizó los andamios en autoclaves a 121°C y 15 psi, y se pusieron en contacto con el medio de cultivo durante un tiempo de 3 horas. Seguidamente, se distribuyó el medio de cultivo en placas de pozos de cultivo y se sembró una concentración de células diferentes para cada fila de la placa. Esto se incubó a 37°C. 

Con el fin de medir correctamente el crecimiento celular, se empleó la técnica de tinción por fluorescencia en cada uno de los casos, incluyendo los controles. 

Tercera etapa: Actividad de la Fosfatasa alcalina 

Con el ánimo de medir la expresión de la enzima Fosfatasa alcalina, se añadieron marcadores de diferenciación osteogénica para cuantificar los andamios SrHAB sembrados, que contienen las células madre en los medios de cultivo y medios de diferenciación de osteoblastos (control). 

Cabe resaltar que esta fase es muy importante, porque se mide cuál de las tres concentraciones de estroncio da como resultado una mayor expresividad de la enzima fosfatasa alcalina en el andamio de manera in vitro. 

En este experimento, una mayor expresividad da a entender que el estroncio está en su concentración óptima, a comparación de los demás. El andamio cuya concentración sobresalga en el crecimiento celular y en la expresividad, será el que se extrapole a los experimentos in vivo. 

Cuarta etapa: Experimentación in vivo

En esta etapa, los investigadores decidieron determinar la expresividad de los genes osteogénicos, extraer el ARN de las células cultivadas en el andamio, y obtener el ADNc para multiplicar el material genético de interés. 

Posteriormente, se inyectan las células con el material genético de manera subcutánea, primero en ratones y luego en ovejas, para medir el crecimiento celular y la formación de hueso ectópico. 

Y ahora... los resultados

Después de aplicar todos los métodos anteriormente descritos, la investigación arrojó los siguientes resultados: 

La concentración de estroncio de 10% demostró un mayor crecimiento celular promedio en la medición del día, 1, 2, 5 y 7, como se puede observar en la Figura 2.

 

Figura 2. Crecimiento celular promedio[2]

A mayor crecimiento celular promedio (estroncio al 10%), se presenta menor desprendimiento del material, por lo que se forman menos porosidades. Es decir, entre mayor concentración de estroncio, hay más porosidades visibles. La cantidad de estroncio incorporado, no afecta la viabilidad de hMSC

En la figura 3a. se muestra la imagen obtenida con el microscópio electrónico de barrido del Sr10HAB; en la figura 3b la correspondiente al Sr30HAB, finalmente la figura 3c, muestra la imagen alusiva a Sr50HAB, todas bajo un aumento de (200 x)

Figura 3. Imágenes con microscopio electrónico de barrido[10]

El Sr10HAB presentó el mayor aumento de actividad de la Fosfatasa Alcalina en el día 10 de cultivo y tuvo mayor impacto en la diferenciación osteogénica comparado con los andamios Sr30HAB y Sr50HAB.  Por lo que el Sr10HAB fué el seleccionado para experimentar in vivo. En la figura 4 se muestra el aumento de la Fosfatasa Alcalina en 5, 10 y 15 días de cultivo. 

Figura 4. Aumento de la fosfatasa alcalina[2] 

Después de 8 semanas de implantación en ratones, estos fueron sacrificados para la recolección de los andamios. En la recolección se observó que habían sido vascularizados con una red de capilares que los penetraban, pero no hubo formación de hueso ectópico. En la Figura 5. se muestran los andamios vascularizados. 

 

Figura 5. Andamios vascularizados en ratones[2] 

Al fémur de las ovejas, cinco semanas después de la implantación, se les realizó radiografías que indicaron que el andamio se insertó en partes del hueso esponjoso y a los defectos del hueso. 

Conclusiones 

En este blog se analizó la investigación citada, donde se resaltan que la ventaja de reforzar el andamio biocerámico con estroncio para aplicarlo en huesos defectuosos, es la capacidad de soportar la diferenciación osteogénica de células madres. 

La proporción óptima de estroncio en el andamio es de 10% por que es donde permite una mayor activación de la enzima fosfatasa alcalina y permite un mayor crecimiento celular. 

Las células madre implantadas fueron cultivadas en el laboratorio y tienen las mismas características que las humanas. Se usa el DNA complementario para asegurar que la multiplicación de estas células conserven la misma información genética. 

Las pruebas in vivo  en ratones presentaron vascularización del andamio pero no formación de hueso; mientras que las pruebas en ovejas indicaron que además de la vascularización, el andamio si se insertó en el fémur. 

En la investigación recomiendan finalmente el uso del andamio Sr10HAB para aplicaciones óseas que soportan carga como en ortopedia y odontología. 

Referencias

[1] Reyes Sánchez, A. and Zárate Kalfópulos, B., 2020. Injertos Óseos En Cirugía Ortopédica. [ebook] pp.2-3. Available at: <https://www.medigraphic.com/pdfs/circir/cc-2006/cc063n.pdf> 

[2] Prabha, R., Ding, M., Bollen, P., Ditzel, N., Varma, H., Nair, P., & Kassem, M. (2020). Strontium ion reinforced bioceramic scaffold for load bearing bone regeneration. Materials Science And Engineering: C, 109. doi: 10.1016/j.msec.2019.110427. p.1.

[3] Qun Wang, ed. (2017). Smart Materials for Tissue Engineering: Fundamental Principles. Cambridge: Royal Society of Chemistry.

[4] Porous and strong bioactive glass (13-93) scaffolds prepared by unidirectional freezing of camphene-based suspensions. Acta Biomater., 8 (2012), pp. 415-423.

[5] Collins. Strontium [Image]. Retrieved from https://www.collinsdictionary.com/es/diccionario/ingles/strontium